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支原體污染會(huì)對細(xì)胞各個(gè)方面都造成不良影響，已經(jīng)成為細(xì)胞培養(yǎng)中高度重視的問題，因此，定期進(jìn)行支原體污染檢測是十分必要的。本支原體檢測試劑盒是采用PCR方法，特異性的檢測各種培養(yǎng)細(xì)胞生物材料（如細(xì)胞培養(yǎng)物、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分泌物、動(dòng)物血清等）中支原體的污染。試劑盒使用的混合引物是針對支原體16s rRNA序列的保守區(qū)域設(shè)計(jì)的特異性引物，可直接使用細(xì)胞培養(yǎng)液作為PCR模板，特異性擴(kuò)增支原體DNA，搭配配套的Mycoplasma PCR Mix（2×）一小時(shí)內(nèi)即可完成，本試劑盒檢測靈敏度高，可檢測低至20個(gè)拷貝的支原體。
組成 | 78EA10015-50T |
Mycoplasma PCR Mix（2×） | 1 mL |
Mycoplasma Primer Mix | 100 μL |
Positive Control | 50 μL |
Mycoplasma Free Water | 1 mL |
1. 樣品準(zhǔn)備：取適量待檢細(xì)胞培養(yǎng)上清于潔凈的PCR管中，利用PCR儀95℃熱處理5 min后作為模板。血清樣本可利用無支原體去離子水水稀釋后，取適量樣本于潔凈的PCR管中，利用PCR儀95℃熱處理5 min后作為模板；
2. PCR體系配制：每次實(shí)驗(yàn)需設(shè)置陰性對照（將1 μL待檢樣品換成等量的無支原體去離子水）與陽性對照（在1 μL待檢樣品中加入0.5 μL Positive Control后一起作為Template），實(shí)驗(yàn)時(shí)戴一次性口罩與手套，謹(jǐn)慎操作，防止操作不當(dāng)引入外源支原體污染；
3. PCR程序設(shè)置：
步驟 | 溫度 | 時(shí)間 | 周期 |
Initial Denaturation | 98℃ | 2 min | 1 |
Denaturation | 98℃ | 20 s | 30 |
Annealing | 56℃ | 25 s | |
Extension | 72℃ | 10 s | |
Final extension | 72℃ | 5 min | 1 |
Hold | 4-16℃ | Forever |
4. 凝膠電泳：取10 μL PCR產(chǎn)物，使用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測；
5. 結(jié)果分析：每次實(shí)驗(yàn)通過與陰性對照、陽性對照檢測結(jié)果比較確認(rèn)樣品支原體污染情況，陽性條帶大小500 bp左右。如陰性對照檢測結(jié)果中有條帶很有可能是P
CR體系中出現(xiàn)污染，建議重新實(shí)驗(yàn)確認(rèn)結(jié)果。如有必要，也可對PCR產(chǎn)物進(jìn)行常規(guī)測序，以確定具體的支原體種屬。
| 貨號(hào) | 品名 | 規(guī)格 | 品牌 |
| 78EA10015-50T | PCR法支原體檢測試劑盒 | 50T | Biohub |
掃碼關(guān)注
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